Datos importantes:
- Incubación del huevo: 9-11 días.
- En caso de tener muestras del pulmón con la enfermedad, se trocea, se rompen las células con el mortero, se centrifuga para quitar los detritus (quedan en el sobrenadante) [o mediante filtración también los podemos separar], y se inocula una vacuna viva atenuada.
El objetivo de esta práctica es aislar el virus e inducir una replicación en la cavidad alantoidea de un huevo SPF (Libres de Patógenos Específicos).
Pasos:
El objetivo de esta práctica es aislar el virus e inducir una replicación en la cavidad alantoidea de un huevo SPF (Libres de Patógenos Específicos).
Pasos:
- Poner el huevo embrionado en el ovoscopio, viendo que está vivo (porque tiene movimientos de deglución, respiración, se le ve el ojo,…). Hay que ver si tiene buen desarrollo. Marcamos con rotulador la cámara de aire y la posición del embrión. Inoculación en cavidad alantoidea.
- Al inocular, romper la cáscara. Dentro está estéril. Desinfectamos con alcohol el punto de auxilio (más alto de aire) y el punto de inoculación (a 0.5 cm desde la línea de la cámara de aire hacia abajo).
- Esterilizar la punta del punzón con calor tras meterlo en alcohol. Dar un punzamiento bien hecho. Por rotación se incide la cáscara y fárfara en punto de auxilio y sólo la cáscara en el punto de inoculación.
- Se vuelve a desinfectar otra vez.
- Con jeringa, 0.5 ml de inóculo y se introduce aguja, sólo el bisel, en cavidad alantoidea. Se introduce perpendicular al huevo y se extrae despacio.
- Con jeringa, 0.5 ml de inóculo y se introduce aguja, sólo el bisel, en cavidad alantoidea. Se introduce perpendicular al huevo y se extrae despacio.
- Desinfectamos los dos puntos, colocamos un papel de celofán encima de los dos, y procedemos a su identificación.
- Incubar a 37º C.
¿Para qué sirve el punto de auxilio?
Según el volumen que introducimos de inóculo, así se desplazará hacia arriba la fárfara,… por ello, el punto de auxilio, ya que es una cavidad hermética, para que salga la cantidad correspondiente de aire, si no, moriría el embrión debido a la presión.
Aparte del inóculo con el virus, realizamos un testigo o control (de igual volumen, pero en lugar de inóculo proveniente del pulmón, con solución salina fisiológica, desinfectándolo las dos veces e introduciéndolo en la estufa).
¿Qué es lo que tiene que suceder?
Se supone que el testigo tendrá un desarrollo normal y el inoculado un retraso en el desarrollo, que, con posterioridad provocará un embrión hemorrágico y muerte del embrión.
¿Para qué sirve el punto de auxilio?
Según el volumen que introducimos de inóculo, así se desplazará hacia arriba la fárfara,… por ello, el punto de auxilio, ya que es una cavidad hermética, para que salga la cantidad correspondiente de aire, si no, moriría el embrión debido a la presión.
Aparte del inóculo con el virus, realizamos un testigo o control (de igual volumen, pero en lugar de inóculo proveniente del pulmón, con solución salina fisiológica, desinfectándolo las dos veces e introduciéndolo en la estufa).
¿Qué es lo que tiene que suceder?
Se supone que el testigo tendrá un desarrollo normal y el inoculado un retraso en el desarrollo, que, con posterioridad provocará un embrión hemorrágico y muerte del embrión.
Dos días después procedemos a la evaluación de los resultados. Dependiendo de la cepa que hemos inoculado habrá muerto o no el embrión. Por ello:
- Abrimos los dos huevos.
- Vemos la replicación en líquido alantoideo.
- Con pipeta Pasteur cogemos un poco de líquido alantoideo y lo colocamos en un porta.
- Miramos los GR de gallina, identificando la presencia de Neuraminidasas y Hemaglutininas,… (En caso de que realicemos el procedimiento en gallinas y no en embriones de pollo).
- Lavamos las células con solución salina fisiológica, quitando membranas y restos de anticoagulante. (8.5 gr de ClNa/litro de agua miliQ)
- Centrifugamos y volvemos a lavar.
- Suspensión al 1% (99% de solución salina fisiológica).
- Mezclamos y homogeneizamos bien la muestra en el porta (tras la extracción con la pipeta Pasteur,…).
¿Qué puede ocurrir?
- Problema: --- Presencia de aglutinados de GR en la mezcla.
HA+ (Aglutinados en toda la mezcla más la parte de líquido alantoideo).
--- HA- (Quedan los GR todos en el centro).
- Testigo: --- HA+ (Poco probable).
--- HA- (Lo más común).
p: problema
t: testigo
p HA+ y t HA- --- Lectura +
p HA- y t HA- --- Lectura –
p HA+ y t HA+ --- Lectura no válida
p HA- y t HA + --- Lectura no válida
Causas de mala identificación del embrión: contaminación del huevo a la hora de la realización del inóculo.
Identificación de Mixovirus en Líquido Alantoideo
-Mediante PCR, Anticuerpos, con M/E,…
-Con la vista --- Identificación morfológica.
+ RNA (ác. Nucleico), proteínas antigénicas que inducen respuesta específica para las mismas (Ac monoclonal).
+ También con suero hiperinmune (inmunizaciones fuertes, alto Título de Ac).
-Con la reacción serológica:
+ Suero hiperinmune + líquido alantoideo a 37º C/1 hora, toda la noche a 4º C.
Si hay especificidad en la reacción --- virus + suero hiperinmune --- Ac bloqueados --- Al añadir unos GR, no hay hemaglutinación, hay inhibición de la hemaglutinación.
