Salmonella spp.
Objetivo:
El objetivo de la práctica es detectar bacterias patógenas en muestras de alimentos mediante la técnica de separación inmunomagnética (SIM).
Material:
- 225 ml de agua de peptona tamponada.
- 25 gr de muestra (carne picada).
- Bolsas para homogeneizado.
- Homogeneizador de palas tipo “Stomacher”.
- Tampón lavador: PBS Tween.
- Pipetas automáticas y tubos de ensayo.
- Placas de Petri y medio de cultivo selectivo (HE y XLD).
- Kit de bolitas “Dynabeads anti-Salmonella”.
- Tubos Eppendorf y agitador.
- Concentrador magnético y placa magnética.
- Asas de siembra, de cultivo y mechero.
- Estufa de 37ºC.
Esquema de trabajo y resultados:
1) Realizar un homogeneizado de la muestra (25 gr) con el diluyente (225 ml de agua peptona tamponada). Esto constituye el preenfriamiento inicial. Se lleva a incubar a 37ºC durante 18 horas. (No es un medio de enriquecimiento selectivo, ya que crecen otras bacterias también). Antes de pasar al siguiente apartado hemos de tener en cuenta que deben existir como mínimo cien Salmonellas en el caldo de preenriquecimiento para que pueda actuar la técnica de SIM, es el umbral necesario.
2) Habiendo colocado un tubo Eppendorf en el concentrador magnético, se llena con 1 ml del caldo no selectivo, añadiéndole 20 microlitros de la solución que contiene las partículas magnéticas que se unirán específicamente a las Salmonellas.
3) Homogeneización (10 minutos) en el concentrador magnético para aumentar el contacto entre las partículas y las Salmonellas.
4) Separación con ayuda de una placa magnética (3 minutos) y agitando para su mejor distribución. De esta manera, las partículas magnéticas quedarán concentradas en su mayoría en el lateral del imán.
5) Retirar el imán y eliminar el sobrenadante, evitando aspirar las partículas con las Salmonellas.
6) Lavado de las impurezas que hay entre las Salmonellas y los Ac (F+) con 1 ml de PBS (Tampón Fosfato) y Tween (jabón detergente).
7) Se procede a repetir el paso número 3, durante otros diez minutos.
8) Se vuelve a separar con la placa magnética (3 minutos) y a retirar el sobrenadante. Aunque terminamos el proceso aquí, lo deseable sería volver a repetir estos tres pasos otra vez más.
9) El último lavado lo reconstituimos con 100 microlitros de solución lavadora (PBS + Tween), que será el volumen suficiente para sembrar en medios sólidos selectivos (HE y XLD).
10) Realizamos la siembra por agotamiento, tras colocar una gota de inóculo en la placa. En la que tiene el medio XLD (Xilosa/Lisina/Desoxicolatosódico), la Salmonella descarboxilará la Lisina, produciéndose una neutralización ácido-base. Las colonias serán rojas. El 99% de las Salmonellas producen ácido sulfhídrico. El centro de las mismas será de color negro. En el caso del HE (Hektoen entérico), será de color verdoso o verde-azulado, apareciendo otras sustancias diferenciales también. El centro, en la mayoría, negro.
11) Para diferenciar las especies de Salmonella se hacen pruebas moleculares (TSI y/o LIA). Son de carácter serológico-bioquímicas.
El objetivo de la práctica es detectar bacterias patógenas en muestras de alimentos mediante la técnica de separación inmunomagnética (SIM).
Material:
- 225 ml de agua de peptona tamponada.
- 25 gr de muestra (carne picada).
- Bolsas para homogeneizado.
- Homogeneizador de palas tipo “Stomacher”.
- Tampón lavador: PBS Tween.
- Pipetas automáticas y tubos de ensayo.
- Placas de Petri y medio de cultivo selectivo (HE y XLD).
- Kit de bolitas “Dynabeads anti-Salmonella”.
- Tubos Eppendorf y agitador.
- Concentrador magnético y placa magnética.
- Asas de siembra, de cultivo y mechero.
- Estufa de 37ºC.
Esquema de trabajo y resultados:
1) Realizar un homogeneizado de la muestra (25 gr) con el diluyente (225 ml de agua peptona tamponada). Esto constituye el preenfriamiento inicial. Se lleva a incubar a 37ºC durante 18 horas. (No es un medio de enriquecimiento selectivo, ya que crecen otras bacterias también). Antes de pasar al siguiente apartado hemos de tener en cuenta que deben existir como mínimo cien Salmonellas en el caldo de preenriquecimiento para que pueda actuar la técnica de SIM, es el umbral necesario.
2) Habiendo colocado un tubo Eppendorf en el concentrador magnético, se llena con 1 ml del caldo no selectivo, añadiéndole 20 microlitros de la solución que contiene las partículas magnéticas que se unirán específicamente a las Salmonellas.
3) Homogeneización (10 minutos) en el concentrador magnético para aumentar el contacto entre las partículas y las Salmonellas.
4) Separación con ayuda de una placa magnética (3 minutos) y agitando para su mejor distribución. De esta manera, las partículas magnéticas quedarán concentradas en su mayoría en el lateral del imán.
5) Retirar el imán y eliminar el sobrenadante, evitando aspirar las partículas con las Salmonellas.
6) Lavado de las impurezas que hay entre las Salmonellas y los Ac (F+) con 1 ml de PBS (Tampón Fosfato) y Tween (jabón detergente).
7) Se procede a repetir el paso número 3, durante otros diez minutos.
8) Se vuelve a separar con la placa magnética (3 minutos) y a retirar el sobrenadante. Aunque terminamos el proceso aquí, lo deseable sería volver a repetir estos tres pasos otra vez más.
9) El último lavado lo reconstituimos con 100 microlitros de solución lavadora (PBS + Tween), que será el volumen suficiente para sembrar en medios sólidos selectivos (HE y XLD).
10) Realizamos la siembra por agotamiento, tras colocar una gota de inóculo en la placa. En la que tiene el medio XLD (Xilosa/Lisina/Desoxicolatosódico), la Salmonella descarboxilará la Lisina, produciéndose una neutralización ácido-base. Las colonias serán rojas. El 99% de las Salmonellas producen ácido sulfhídrico. El centro de las mismas será de color negro. En el caso del HE (Hektoen entérico), será de color verdoso o verde-azulado, apareciendo otras sustancias diferenciales también. El centro, en la mayoría, negro.
11) Para diferenciar las especies de Salmonella se hacen pruebas moleculares (TSI y/o LIA). Son de carácter serológico-bioquímicas.
a) TSI:
Se toma con el asa de cultivo una colonia, introduciéndola en el final del tubo de ensayo y realizando una estría lateral. Se incuba a 37ºC durante 18h, viéndose las lecturas de los cambios de color.
El agar TSI presenta Lactosa, Sacarosa y Glucosa, así como sustancias con Hierro para ver la producción de ácido sulfhídrico. La Salmonella no fermenta ni Lactosa ni Sacarosa, pero sí Glucosa. Los resultados se obtendrán observando la coloración del agar inclinado y en profundidad, siendo Álcali (K) cuando sean colores morados o rojizos, y Ácido (A) si son amarillentos. Asimismo habrá que mirar si se produce ácido sulfhídrico y gas (hay burbujas).
La reacción típica es: K - A / + / - , que indica Álcali en superficie, Ácido en profundidad, producción de ácido sulfhídrico y no presencia de gas.
Resultados obtenidos: en esta prueba debimos hacer algún paso mal, ya que no salió nada concluyente.
b) LIA:
La inoculación es similar. Se fundamenta en que la Salmonella descarboxila la Lisina. También lleva Hierro para observar si se produce ácido sulfhídrico.
La reacción típica es K – A/K / + / - , que indicaría Álcali en superficie, Ácido o Álcali en profundidad, producción de ácido sulfhídrico y descarboxila la Lisina.
Resultados obtenidos: K – K / + / - , con lo que la coloración es morada tanto el superficie como en profundidad, es Álcali y descarboxila la Lisina.
Se toma con el asa de cultivo una colonia, introduciéndola en el final del tubo de ensayo y realizando una estría lateral. Se incuba a 37ºC durante 18h, viéndose las lecturas de los cambios de color.
El agar TSI presenta Lactosa, Sacarosa y Glucosa, así como sustancias con Hierro para ver la producción de ácido sulfhídrico. La Salmonella no fermenta ni Lactosa ni Sacarosa, pero sí Glucosa. Los resultados se obtendrán observando la coloración del agar inclinado y en profundidad, siendo Álcali (K) cuando sean colores morados o rojizos, y Ácido (A) si son amarillentos. Asimismo habrá que mirar si se produce ácido sulfhídrico y gas (hay burbujas).
La reacción típica es: K - A / + / - , que indica Álcali en superficie, Ácido en profundidad, producción de ácido sulfhídrico y no presencia de gas.
Resultados obtenidos: en esta prueba debimos hacer algún paso mal, ya que no salió nada concluyente.
b) LIA:
La inoculación es similar. Se fundamenta en que la Salmonella descarboxila la Lisina. También lleva Hierro para observar si se produce ácido sulfhídrico.
La reacción típica es K – A/K / + / - , que indicaría Álcali en superficie, Ácido o Álcali en profundidad, producción de ácido sulfhídrico y descarboxila la Lisina.
Resultados obtenidos: K – K / + / - , con lo que la coloración es morada tanto el superficie como en profundidad, es Álcali y descarboxila la Lisina.
