DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE MEDIANTE AISLAMIENTO-IDENTIFICACIÓN

Datos importantes:

- Incubación del huevo: 9-11 días.

- En caso de tener muestras del pulmón con la enfermedad, se trocea, se rompen las células con el mortero, se centrifuga para quitar los detritus (quedan en el sobrenadante) [o mediante filtración también los podemos separar], y se inocula una vacuna viva atenuada.

El objetivo de esta práctica es aislar el virus e inducir una replicación en la cavidad alantoidea de un huevo SPF (Libres de Patógenos Específicos).

Pasos:

- Poner el huevo embrionado en el ovoscopio, viendo que está vivo (porque tiene movimientos de deglución, respiración, se le ve el ojo,…). Hay que ver si tiene buen desarrollo. Marcamos con rotulador la cámara de aire y la posición del embrión. Inoculación en cavidad alantoidea.

- Al inocular, romper la cáscara. Dentro está estéril. Desinfectamos con alcohol el punto de auxilio (más alto de aire) y el punto de inoculación (a 0.5 cm desde la línea de la cámara de aire hacia abajo).

- Esterilizar la punta del punzón con calor tras meterlo en alcohol. Dar un punzamiento bien hecho. Por rotación se incide la cáscara y fárfara en punto de auxilio y sólo la cáscara en el punto de inoculación.

- Se vuelve a desinfectar otra vez.
- Con jeringa, 0.5 ml de inóculo y se introduce aguja, sólo el bisel, en cavidad alantoidea. Se introduce perpendicular al huevo y se extrae despacio.

- Desinfectamos los dos puntos, colocamos un papel de celofán encima de los dos, y procedemos a su identificación.

- Incubar a 37º C.

¿Para qué sirve el punto de auxilio?
Según el volumen que introducimos de inóculo, así se desplazará hacia arriba la fárfara,… por ello, el punto de auxilio, ya que es una cavidad hermética, para que salga la cantidad correspondiente de aire, si no, moriría el embrión debido a la presión.

Aparte del inóculo con el virus, realizamos un testigo o control (de igual volumen, pero en lugar de inóculo proveniente del pulmón, con solución salina fisiológica, desinfectándolo las dos veces e introduciéndolo en la estufa).

¿Qué es lo que tiene que suceder?
Se supone que el testigo tendrá un desarrollo normal y el inoculado un retraso en el desarrollo, que, con posterioridad provocará un embrión hemorrágico y muerte del embrión.

Dos días después procedemos a la evaluación de los resultados. Dependiendo de la cepa que hemos inoculado habrá muerto o no el embrión. Por ello:
- Abrimos los dos huevos.
- Vemos la replicación en líquido alantoideo.
- Con pipeta Pasteur cogemos un poco de líquido alantoideo y lo colocamos en un porta.
- Miramos los GR de gallina, identificando la presencia de Neuraminidasas y Hemaglutininas,… (En caso de que realicemos el procedimiento en gallinas y no en embriones de pollo).
- Lavamos las células con solución salina fisiológica, quitando membranas y restos de anticoagulante. (8.5 gr de ClNa/litro de agua miliQ)
- Centrifugamos y volvemos a lavar.
- Suspensión al 1% (99% de solución salina fisiológica).
- Mezclamos y homogeneizamos bien la muestra en el porta (tras la extracción con la pipeta Pasteur,…).

¿Qué puede ocurrir?
- Problema: --- Presencia de aglutinados de GR en la mezcla.
HA+ (Aglutinados en toda la mezcla más la parte de líquido alantoideo).
--- HA- (Quedan los GR todos en el centro).

- Testigo: --- HA+ (Poco probable).
--- HA- (Lo más común).

p: problema
t: testigo

p HA+ y t HA- --- Lectura +
p HA- y t HA- --- Lectura –
p HA+ y t HA+ --- Lectura no válida
p HA- y t HA + --- Lectura no válida

Causas de mala identificación del embrión: contaminación del huevo a la hora de la realización del inóculo.

Identificación de Mixovirus en Líquido Alantoideo

-Mediante PCR, Anticuerpos, con M/E,…
-Con la vista --- Identificación morfológica.
+ RNA (ác. Nucleico), proteínas antigénicas que inducen respuesta específica para las mismas (Ac monoclonal).
+ También con suero hiperinmune (inmunizaciones fuertes, alto Título de Ac).
-Con la reacción serológica:
+ Suero hiperinmune + líquido alantoideo a 37º C/1 hora, toda la noche a 4º C.
Si hay especificidad en la reacción --- virus + suero hiperinmune --- Ac bloqueados --- Al añadir unos GR, no hay hemaglutinación, hay inhibición de la hemaglutinación.

DETERMINACIÓN DE CLEMBUTEROL POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Introducción y usos

El Clembuterol es un fármaco empleado en enfermedades respiratorias como broncodilatador. Desde hace treinta años se tiene constancia de que los animales alimentados con clembuterol aumentaban su masa muscular en detrimento de sus grasas. Estos efectos son similares a los producidos por otros beta-agonistas, en concreto su acción es principalmente B1, aunque también B2 y alfa.

El clembuterol es legal como medicamento por su efecto relajante de la musculatura lisa, por ser útil como broncodilatador (en la EPOC equina) o por actuar como tocolítico para partos complicados. Asimismo estimula el depósito de proteínas y contribuye a la reducción del depósito de grasas (por ello se empezó a usar como hormona esteroidea; su problema es que permanece en la carne). El nombre comercial es Ventipulmin.

Los residuos de Clembuterol pueden afectar las funciones de pulmones y corazón en seres humanos, que ingieren carne o hígado de animales a los que les ha sido administrado clembuterol. En 1990 se produjo una muerte humana en Asturias; sus síntomas fueron inespecíficos (fallo respiratorio, no termorregulación, palpitaciones, náuseas, boca seca,…). Era un cuadro parecido a la intoxicación por un beta-agonista. Parece ser que se trataba de un hombre que había estado comiendo durante mucho tiempo carne de vacas a las que se le había administrado gran cantidad de clembuterol de manera constante. Actualmente se sabe que demasiado clembuterol en la carne no actúa como un promotor, sino como un estimulante del crecimiento.

Farmacocinética

Es un fenilaminoetanol con propiedades adrenérgicas que puede ser administrado por vía oral o intravenosa en los animales, almacenándose en el hígado (donde se produce su metabolización). Su excreción principal es por la orina (50-85%), por las heces (10%) y, en menor grado por la leche (1-5%).

En el caso de humanos, su absorción por vía oral es rápida y casi completa a los 45 minutos alcanzando unos niveles máximos en plasma a las 2 horas. Su eliminación es principalmente por orina (hasta el 90%).

Muestras a tomar:

- Orina.
- Hígado (si nos encontramos en un matadero).
- Acúmulo de humor vítreo (es menos seguro).

Determinación:

+ ELISA: es útil, barato y nos permite analizar 96 muestras a la vez. Si se genera una reacción Ag/Ac, cambia el color. Su principal inconveniente es que pueden existir falsos positivos. De todos modos nos sirve como “screening” previo; lo que sí sabemos es cuándo es negativo y cuándo positivo, acotando mucho. En el caso de muestras dudosas pasamos a los siguientes métodos.
+ Cromatografía de masas/gases: es un método físico de separación donde los componentes a separar se distribuyen en dos fases, una es la fase estacionaria y la otra es un fluido (fase móvil), que pasa a través de una superficie (la anterior fase estacionaria). Es más exacta, obteniéndose valores en ppm o %. En el supuesto de tratarse de un informe pericial los resultados se deberían obtener mediante este método.
+ Cromatografía en capa fina: es rápida y barata. Su procedimiento lo analizo a continuación.

1.- Fundamento:
La muestra que podemos tomar puede ser de hígado o de orina, principalmente.
Si es hígado, éste se tritura, se digiere en ácido y se centrifuga. Se cogen 10 ml de sobrenadante y, con ayuda de la adición de gotas o pastillas de NaOH lo llevamos a pH 10-11, purificándolo y evaporando el metanol echado con el kit de purificación. Tras su evaporación resuspendo en acetato de etilo y lo aplico a la placa de sílice. El clembuterol lo podremos observar tras formar un azo-derivado con nitrito sódico y naftilen-diamina.
Como no vamos a trabajar con muestras de hígado sino con orina, el protocolo es más sencillo (ver 4.-Determinación).

2.- Material:
- Cubeta cromatográfica.
- Placas de HPTLC de silicagel 60, 5 x 5 cm.
- Matraces.
- Micropitetas y pipetas graduadas.
- Pipetas Pasteur.

3.- Reactivos:
- Clembuterol.
- Agua milli-Q o milli-Ro.
- NaOH.
- Cartuchos de C18 de 300 mg.
- Ter-butilmetil éter.
- Ácido acético.
- Ácido clorhídrico (1 N y 0.01 N).
- Acetato de etilo.
- Metanol HPTLC.
- Nitrito sódico.
- Gas nitrógeno.
- Naftiletilendiamina dihidroclorada (y al 0.4% en metanol).
- NaOH (2 N y 0.1 N).
- Nitrito sódico (al 1% en HCl 1 N).
- Eluyente de la capa fina (acetato de etilo: metanol: ácido acético --8:1:1).

4.- Determinación:
En la gradilla tenemos cuatro tubos: dos muestras, un blanco y un patrón (éste se hace a partir de otro patrón más concentrado con HCl). La extracción ya está realizada por lo que pasamos directamente a la purificación.
* Purificación:
- Preparamos los cartuchos de C18 pasando primero 5 ml de metanol y luego 5 ml de agua milli-Q.
- Pasamos por uno de los cartuchos de C18 la muestra (M4) y por el otro cartucho el blanco o patrón (en nuestro caso, patrón P2).
- Lavamos los cartuchos con 5 ml de agua milli-Q y, después, con 5 ml de una mezcla que hemos preparado de metano/agua (50-50) durante 2-3 ocasiones.
- Eluimos el supuesto clembuterol presente en los cartuchos con 3 ml de metanol y lo recogemos en un tubo de cristal para su evaporación.
- Evaporamos el metanol con la ayuda de nitrógeno (a 55º C o en un baño a 90ª C).
- Disolvemos la materia seca en 50 µL de acetato de etilo.
* Detección :
- Aplicamos la mitad de la disolución en una placa cromatográfica.
- Colocamos la placa en una cubeta hasta que el eluyente alcance el 60% de la misma aproximadamente.
- Dejamos secar la placa al aire.
- Se sumerge brevemente la placa en una solución de nitrito sódico 1% en HCl 1 N.
- Volvemos a secar la placa al aire.
- Sumergimos nuevamente la placa, pero en una solución de naftiletilendiamina 0.4%.
- Dejamos secar.
- El clembuterol presentará una mancha rosada (cualitativa) con una Rf de 0.4 aprox.
Fr = R / r -- Rf = r / R = d / D
El Rf del patrón (con clembuterol) es d / D <>

5.- Resultados:
+ Datos:
N = M x Valencia (la del HCl es 1).
M = moles/litro
Pm= 36.5
1litro= 1.19 kg.
37% (M/M – gr/gr).
Disolución 1 N HCl (100 ml).
¿M?

+ Cálculos:
37 gr x 1 mol x 1190 gr = 12.06 M
100gr x 36.5gr x 1 L
12.06 M x V1 = 1 M x 100 ml
V1 = 8.3 ml

+ Resultados:
La distancia en la placa cromatográfica desde la marca rosa de la muestra M4 hasta el lugar de aplicación de la misma fue de 2 cm, exactamente igual que la de la muestra patrón P2. El grupo vecino no obtuvo resultado positivo (tenían el blanco B2 y la muestra M3).

Rf = 2 / 4.5 = 0.44 -- el Rf del clembuterol es 0.4, con una desviación de (+/-) 0.05.

ELEMENTOS BÁSICOS EN UN LAB. DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Cabinas de Seguridad Biológica (esquemas).

APARATOS
Los equipos necesarios en el procesamiento de una muestra para estudio infeccioso son:
- Estufas.
- Neveras.
- Congeladores.
- Centrífugas.

De manera periódica debe controlarse la temperatura, humedad/presión de CO2 de cada estufa/nevera/congelador al inicio de la jornada de trabajo con un termómetro situado permanentemente en el centro de cada equipo.

El termómetro debe permitir la medida de la temperatura máxima y mínima alcanzadas. Se anotará en la hoja de registro de temperatura de cada aparato. De una manera genérica se sugieren los siguientes intervalos de aceptación:

Estufas
- estufas de 35-37°C se acepta una mínima superior o igual a 34°C y máxima inferior o igual a 37,5°C
- estufas de 42°C se aceptan variaciones entre 40-43°C
- estufas de 30°C se aceptan variaciones entre 28-32ºC Para las neveras el intervalo de tolerancia que se acepta es generalmente de 2º-8°C, aunque puede variar en función de los reactivos que contengan.

Todos los termómetros utilizados en la medida de temperaturas de los aparatos se han de verificar mediante un termómetro de referencia calibrado. Se introducirá el termómetro utilizado para la medición de la temperatura y el termómetro calibrado en el equipo correspondiente (nevera, congelador o estufa) durante un mínimo de 15 minutos.

Existen sistemas automáticos para el control de la temperatura, humedad, presión de CO2, etc., que controlan de una manera permanente (en intervalos de 15-20 minutos) los anteriores parámetros con gran fiabilidad y que utilizan sondas de referencia verificadas por organismos certificados.

Centrífugas
Cuando se centrifugue material biológico potencialmente infeccioso deben utilizarse tubos cerrados; la centrífuga debe disponer de rotores o cestillos de seguridad que protejan al operador de los posibles aerosoles.

La rotura accidental de un tubo y su vertido en la cubeta representa una incidencia importante que debe ser comunicada inmediatamente al supervisor o responsable, de forma que se proceda a la desinfección segura del aparato.

No se deben utilizar centrífugas antiguas que no posean sistema de cierre de seguridad, del que disponen todos los aparatos actuales, ni manipular éstas de forma que permitan su apertura mientras están en funcionamiento.

Si el laboratorio dispone de ultracentrífugas, el equilibrado cuidadoso del rotor es fundamental.
Dentro de este apartado, hay que puntualizar que su uso es distinto dependiendo de cómo sean las muestras. Así:

- Hay que centrifugar todos los líquidos en volumen superior a 1ml a 2.500 rpm durante 15 minutos
- Centrifugar sangre a 3.500 rpm durante 3-5 minutos para detección de antígenos y/o anticuerpos
- Otras técnicas de concentración específicas: precipitación en etanol, ultracentrifugación selectiva, etc.

Incubadoras

Temperatura (varía según el tipo de cultivos, por ejemplo)
- La mayoría de los cultivos bacterianos se incuban a 35-37ºC
- El aislamiento de Campylobacter spp. de heces requiere una temperatura de incubación de 42ºC
- La mayoría de los cultivos para hongos se incuban a 30°C

Atmósferas de incubación
- Aerobiosis
- Atmósfera enriquecida con 5-7% de CO2
- Atmósfera microaerofílica para el aislamiento de Campylobacter spp. : 5% de O2, 10% CO2 y 85% de N2.
- Atmósfera de anaerobiosis

BARRERAS PRIMARIAS
Las barreras primarias son la primera línea de defensa cuando se manipulan materiales biológicos que puedan contener agentes patógenos. El ejemplo más claro de contención primaria lo constituyen las cabinas de seguridad biológica.

Cuando no es posible el aislamiento del foco de contaminación, la actuación va encaminada a la protección del trabajador mediante el empleo de prendas de protección personal. En la mayoría de las ocasiones se practica la combinación de ambos tipos de medidas, tal como puede ser el empleo de la cabina junto con guantes y mascarilla. Todo ello sin olvidar que la máxima contención del riesgo biológico sólo se da cuando, además, se emplean las técnicas de trabajo correctas unidas a un diseño del laboratorio

A) CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA (CSB)
Son cámaras de circulación forzada que, según sus especificaciones y diseño, proporcionan diferentes niveles de protección. Son fundamentales en un Laboratorio de Infecciosas y se clasifican según el nivel y tipo de protección.

En principio es necesario distinguir entre las campanas de extracción de gases, las cabinas de flujo laminar y las cabinas de Seguridad Biológica.

La campana de gases (o vitrina extractora de gases) es un recinto ventilado que captura los humos y vapores procedentes de la manipulación de los productos químicos en el laboratorio. Si bien constituye un equipo muy útil en la contención del riesgo químico, no ofrece protección alguna frente a riesgos biológicos.

Las cabinas de flujo laminar son recintos que emplean un ventilador para forzar el paso del aire a través de un filtro HEPA barriendo la superficie de trabajo. El flujo de aire puede ser vertical u horizontal. Estas cabinas ofrecen protección únicamente al material que se maneja en su interior, pero nunca al operador, por lo que no son recomendables. Son, sin embargo, un instrumento de trabajo imprescindible en las denominadas "zonas limpias".

Las Cabinas de Seguridad Biológica (CSB) son recintos ventilados diseñados para limitar al máximo el riesgo del personal de laboratorio expuesto a agentes infecciosos. Ello es especialmente importante si se tiene en cuenta que muchas de las operaciones realizadas en un laboratorio implican la formación de aerosoles. Estos equipos tienen como objetivo principal proporcionar una zona de trabajo que minimice la probabilidad que una partícula transportada por el aire tiene de escapar hacia el exterior de la cabina y contaminar así al operario y a la zona que le rodea. Además, algunas de ellas, ofrecen protección al material que se manipula.

Las CSB disponen de dos sistemas que impiden la salida de contaminación: las barreras de aire y los filtros. Las barreras de aire se crean permitiendo que éste fluya en una sola dirección y a una velocidad constante dando lugar a una verdadera "cortina" de aire que se conoce como flujo de aire laminar. Es, por definición, un flujo con ausencia de turbulencias. Los filtros tienen como finalidad atrapar las partículas contenidas en este flujo de aire y los empleados habitualmente son los HEPA, que retienen con una eficacia del 99,97% partículas de hasta 0,3 micras de diámetro.

Las CSB se dividen en tres categorías: clases I, II y III.
Cabinas de clase I. Son cámaras cerradas con una abertura al frente para permitir el acceso de los brazos del operador. El aire penetra por este frontal, atraviesa la zona de trabajo y todo él sale al exterior a través de un filtro HEPA. La velocidad del flujo de aire es de unos 0,40 m/s (75 pies/m). Son apropiadas para manipular agentes biológicos de los grupos 1, 2 ó 3. La mayor desventaja que presentan es que no proporcionan protección al material con el que se trabaja, no evitando por lo tanto que éste se pueda contaminar.

Cabinas de clase II. Se diferencian principalmente de las de clase I en que, además de al operario y su entorno, ofrecen protección al producto frente a la contaminación. La superficie de trabajo está bañada por aire limpio que ha atravesado un filtro HEPA. La salida del aire se produce a través de otro filtro HEPA. Son equipos válidos para el manejo de agentes biológicos de los grupos 1, 2 ó 3. Existen varios tipos de cabinas de clase II, A, B1, B2 y B3, según sus características de construcción, flujo de aire y sistema de extracción.

Una primera diferencia entre tipo A y tipo B es que las de clase II tipo A están diseñadas para que el aire extraído desemboque en el mismo laboratorio o fuera de éste vía una conexión de tipo “Canopo” y las de tipo B deben disponer de un conducto hermético de salida, exclusivo para ellas, con un extractor y un sistema de alarma apropiado. Las IIA y las IIB3 mantienen ambas una velocidad de 0,40-0,50 m/s (75-100 p/m) y en ambas también se recircula un 70% del aire. Cuando la IIB3 se conecta al exterior mediante conducto hermético, entonces se puede emplear para manipulaciones que impliquen muy pequeñas cantidades de productos tóxicos y radionucleidos.

Las restantes cabinas del tipo B, es decir IIB1 y IIB2, se diferencian principalmente en la velocidad del flujo y la proporción de aire que se recircula. En estos dos tipos, la velocidad mínima es de 0,50 m/s (100 p/m), siendo la cantidad recirculada del 30-50% en las de clase II tipo B1 y del 0% en las de tipo B2. Tanto unas como otras son adecuadas para el trabajo con pequeñas cantidades de tóxicos y radionucleidos.

Cabinas de clase III. Constituyen el máximo nivel de seguridad. Son recintos herméticos en presión negativa y, por ello, su interior está completamente aislado del entorno. Se opera en ellas por medio de unos guantes, con trampa para introducir el producto, el aire entra a través de un filtro HEPA y se expulsa al exterior a través de dos filtros HEPA. Se recomiendan para el manejo de agentes de los grupos 1, 2, 3 ó 4.

BARRERAS SECUNDARIAS
El diseño y construcción de un laboratorio (lo que en Seguridad Biológica se conoce como "barreras secundarias") contribuye a la protección del propio personal del laboratorio, proporciona una barrera para proteger a las personas que se localizan fuera del laboratorio.

Localización. Es aconsejable que el Laboratorio de Infecciosas se localice fuera del tráfico del hospital o facultad de veterinaria, y que no sea un lugar de paso para otras dependencias en las que no exista restricción para su acceso (cafeterías, almacenes, bibliotecas, aparcamientos).

Acceso de personal. En general, debe ser restringido a las personas formadas para el manejo de agentes infecciosos. Para un nivel 2 de contención es suficiente que la puerta del laboratorio pueda cerrarse con llave, mientras que para el nivel 3 la puerta ha de ser doble además de recomendarse un cambio de ropa.

Lavabo. Debe existir uno en el mismo laboratorio. Estará dotado de grifos que puedan accionarse sin utilizar las manos y situado preferiblemente cerca de la puerta de salida.

Lavaojos. Se recomienda que exista uno dentro del laboratorio como equipo de emergencia.

Superficies interiores. Los suelos, paredes y techos deben ser impermeables al agua y resistentes a diferentes productos químicos, de forma que permitan una limpieza a fondo y una posterior descontaminación. En el nivel 3 de contención, además, todas las penetraciones deben ir selladas.
Superficies de trabajo. Las mesas y bancos de trabajo deben ser resistentes al calor moderado, a disolventes orgánicos, ácidos y álcalis.

Señalización. Siempre que el trabajo esté en marcha, debe colocarse en la puerta del laboratorio la señal reglamentaria de peligro biológico.

Presión negativa. Se recomienda que el laboratorio se mantenga a una presión negativa con respecto al exterior del mismo, es decir, con respecto a los pasillos u otras zonas del edificio, de manera que exista un flujo de aire desde las zonas menos contaminadas hacia las de mayor riesgo de contaminación. Las puertas y ventanas del laboratorio han de permanecer cerradas si se quiere mantener esa presión negativa. No es aconsejable la recirculación de aire.

Filtros HEPA. No existe legislación en España en cuanto a sistema y frecuencia para su comprobación pero, siguiendo directrices de otros países, parece aconsejable hacerla cada 6 meses o, al menos, no dejar pasar más de 14 meses. Deberá realizarla siempre una empresa especializada.

Residuos. Además de la normativa general que la facultad establezca, en función de la legislación vigente, en materia de residuos biosanitarios, en un nivel 3 se recomienda que en el mismo laboratorio exista algún sistema para el tratamiento de los residuos producidos. De no ser así, el transporte de estos residuos ha de realizarse en envases sellados (ver más adelante el apartado específico).

Nivel 4 de contención. Las características de diseño enumeradas se hacen obligatorias en el caso del nivel 4 de contención, además de otras, como el empleo de cabinas de clase III (o equipo de protección similar para los operarios), filtro HEPA a la entrada del aire, doble filtro HEPA a la salida del aire, etc.

NEVERAS, HABITACIONES FRIGORÍFICAS Y MICROONDAS
Hay que tener en cuenta lo siguiente:

No deben almacenarse cultivos de microorganismos patógenos por inhalación en recipientes que no estén convenientemente cerrados, especialmente si la cámara tiene un sistema de circulación de aire.

No deben almacenarse reactivos que contengan compuestos volátiles inflamables (éter etílico, por ejemplo) en neveras que no posean un sistema de protección antideflagración. En los aparatos de tipo doméstico que se utilizan en el laboratorio debe anularse la lámpara de la luz.

A) CONGELADORES
La congelación es un proceso que mantiene la viabilidad de muchos agentes infecciosos, de ahí un potencial riesgo y las siguientes recomendaciones:

Tratar de identificar en ficheros, listas, etc. el contenido de lo almacenado y sus riesgos potenciales.

El material potencialmente infeccioso debe colocarse en tubos, recipientes, etc. bien cerrados. No se llenarán completamente, para evitar que rebosen por efecto del aumento de volumen tras la congelación.

Descongelar periódicamente, limpiar y desinfectar si fuese procedente.

Utilizar guantes para manipular el contenido. Si la temperatura es baja (por ejemplo -70ºC o inferior), los guantes representan una protección adicional.

B) MICROONDAS
Los microondas cada vez son más populares en el Laboratorio de Infecciosas y constituyen una nueva fuente de accidentes, entre los más frecuentes las explosiones cuando se usan para calentar medios con agar, ya que la diferencia de velocidad de calentamiento produce burbujas que pueden estallar.

Las botellas o matraces deben tener el tapón aflojado, ya que si está cerrado estallan fácilmente.
Estar siempre presente, con la ropa y pantalla facial adecuadas, y controlar la intensidad del aparato, que sólo puede ser la máxima con agua y la mínima si se usa con agar.

Deberá existir una tabla bien visible de los tiempos en cada posición del potenciómetro y de las cantidades a emplear.

Los microondas interfieren con los marcapasos. No deben ser colocados a una distancia inferior a 2 m de las personas que sean portadoras de uno de estos dispositivos.

C) AUTOCLAVES
Los autoclaves deben poseer manómetro y termostato, así como válvula de seguridad, sistema de desconexión rápido y la purga del vapor ha de realizarse a un recipiente estanco y con agua, jamás directamente al exterior.

No deben usarse si no se conocen perfectamente todos los mandos y su fundamento.

Usar guantes especiales para protegerse del calor.

No abrir jamás si el manómetro no está a "0" y la purga no ha sido abierta.

Controlar una vez al mes su capacidad de desinfección mediante esporas, no siendo suficiente el método químico. El uso de registros de presión y temperatura de cada proceso y la instauración de un programa de mantenimiento también puede ser una alternativa válida al control mediante esporas. El agua debe ser cambiada regularmente.

Aparte de todos estos elementos, en un Laboratorio de Enfermedades Infecciosas son necesarios otros instrumentos tales como microscopios y todo lo relacionado con ellos y con el procedimiento de preparación de muestras (portas, cubreobjetos, placas de Petri, colorantes para tinciones, parafina,…), otros indispensables en cualquier laboratorio (pipetas de todo tipo, matraces, pinzas, tijeras, lupas,…), y no podemos olvidarnos de las cámaras frigoríficas (a -10º C, a 4º C,… para poder guardar los tanques de Nitrógeno Líquido, medios TSA, TSF,…), y otros almacenes para sustancias peligrosas o explosivas, siempre con la debida identificación en la puerta.

"PULCHRA LEONINA"

MANEJO DE GRANDES ANIMALES

Filete y Bocado (partes).

Aunque en este apartado me voy a extender analizando métodos de manejo y derribo de animales como los Bóvidos y los Équidos, también mencionaré algunos procedimientos a realizar en caso de tener Suidos o Carnívoros.

En general, este tipo de actuaciones requieren la imbricación de dos elementos importantes: la experiencia del veterinario para evitar producir lesiones al animal y, a la vez, que no se altere el animal psicológicamente, ya que ello podría derivar en problemas a nivel fisiológico.

Al igual que no se parecen los mecanismos entre grandes y pequeños animales, tampoco entre los animales incluidos en cada una de las categorías; los caballos se manejan de modo distinto que las vacas, todo ello debido al uso que tienen, su carácter, su relación con el hombre,… Pero lo que hay que tener en cuenta, independientemente de la colectividad, es si es un animal especial, que suele tener reacciones violentas o si posee algún dolor o afección que pudiera desencadenar algún incidente con el veterinario al realizar su trabajo.

Équidos (y Bóvidos):

Son animales bastante nerviosos a pesar de que estén acostumbrados al hombre. El tratamiento que se le dé implica un mayor o menor nerviosismo.

Para entrar en la caballeriza hemos de hacerlo evitando ruidos y movimientos rápidos y bruscos, máxime si el animal nos extraña. Ello no significa que tengamos miedo al animal o estemos en tensión, todo lo contrario, hay que ser decididos, acariciar al animal e intentar hablarle con un tono de voz suave, porque así se tranquilizan. No debemos olvidarnos que son animales muy voluminosos, cualquier movimiento que realicen, por pequeño que sea, puede lesionarnos gravemente, por esto mismo tenemos que estar en guardia también.

La aproximación al animal se hace por su lado izquierdo, a la altura de la espalda, sin olvidarnos de que si tiene la cara muy tensa, las orejas mirando hacia atrás y “caídas” y moviendo la cola con gran efusividad es mejor alejarse con cuidado, porque está enfadado y puede soltar una coz o "algo peor".

Hay que recordar que nunca debemos mirar fijamente a los ojos del caballo, ya que, al ser éste un animal de presa, cree que le estamos amenazando, denota agresividad por nuestra parte.

Partiendo de todas estas premisas procedemos a la realización propia de la práctica:
Aprender a entrar en la caballeriza.
Poner la cabezada al animal.
Acercarnos y colocarnos a la altura de la espalda.
Aprender a coger las patas delanteras y traseras, para una hipotética limpieza de cascos o cambio de herraduras. Aquí tenemos que sacar al animal de su cama, y lo atamos con una cuerda a los barrotes, siempre dejando un trozo corto y alto, para evitar que se ahogue al intentar meter una mano. El nudo que se hace debe ser fácil de desatar por el veterinario, por si ocurre que se cae el caballo, para evitar que se asfixie.

- Para levantar las extremidades delanteras acariciamos los tendones a la altura de los menudillos, (arriba y abajo). Esto debe ser suficiente para que levante la pata, si no es el caso, empujamos con nuestro hombro intentando desequilibrarlo hacia el otro lado a la altura de la espalda. Después pasamos nuestra pierna contralateral por encima de la suya con el fin de que quede su extremidad entre nuestras dos piernas, por encima de las rodillas. Nuestra posición es con las rodillas flexionadas, los pies hacia dentro y agachados, de modo que nos queden las manos sueltas para poder actuar libremente.
- Si queremos levantar las patas de atrás, realizamos el mismo procedimiento (acariciar los tendones, empujar con el hombro), pero aquí tenemos que empujar también de la extremidad hacia delante (desde nuestra perspectiva) para estirar la pata, de manera que podamos sujetar su extremidad con nuestras dos piernas y con nuestro cuerpo en parte, dejando libertad igualmente a las manos.

Aprender el funcionamiento del torcedor o acial, las mordazas, los trabones, el atapié, el freno alemán, el freno gaucho,…
- Torcedor: se coloca en el belfo superior, provocando un reflejo que unos autores lo califican de analgésico (ya que el animal pone cara de sueño) y otros argumentan que se produce desviación del dolor.
- Freno alemán: funciona parecido al torcedor (es un nudo corredizo en la boca y la nuca).
- Mordaza gaucha: es útil para realizar inyecciones.
Aparte de estos anteriores más usados, también hay otros mecanismos y acciones que podemos nombrar y complementan en este y otros campos:
- Bastón conductor: mantiene una distancia de seguridad entre el animal y el cuidador.
- Collares de bastones: ayudan en el proceso de curación, ya que impiden que los caballos se arranquen las vendas.
- Bozal: tiene la misma utilidad que el anterior y también se usa cuando no queremos que ingieran alimento.
- Mandil de cuero o goma: colocado a continuación de la cabezada inferiormente, evitando que muerdan los vengajes. También se usan en el momento de la cubrición, ya que protegen al manso de una posible coz por parte de la hembra.
- Tapar los ojos: muy útil cuando queremos que el caballo se tranquilice y deje trabajar mejor al veterinario.
- Subir o bajar la cabeza: dependiendo de la extremidad que se esté explorando, impide en cierta medida que levante la extremidad.
- Si el animal está viendo lo que el veterinario le está haciendo no se asusta tanto y le deja hacer más fácilmente que de la otra forma.
- Uso de narigones, tenazas o anillos nasales, mochetas (de Harms, Haake, Reetz,…).

Los trucos más usados son:
- Bajar la cabeza cuando se actúa sobre la extremidad delantera.
- Subir la cabeza cuando se actúa sobre la extremidad trasera.
- Cargar peso hacia la derecha, evitando que dé una coz hacia ese lado. Le levantamos la izquierda de paso, y viceversa.
- Coger pliegue de piel (dolor). No se mueve y se le distrae de otra actuación que se le esté haciendo.
- Taparle los ojos.
- Tirar de la cola, se está más quieto, aunque si es listo, puede dar alguna coz. Es muy usado en potros.

La sujeción de las extremidades se realiza:
- tenemos que especificar que los caballos se sostienen muy bien sobre bípedos diagonales, por lo que, si quieren dar una coz, aún cuando ello implique que caigan al suelo, lo harán;
- utilizamos atapié: es una cuerda que la atamos a la pata y al propio antebrazo de la misma, quedando suspendida en el aire;
- uso de trabas, que atan una mano a la otra contralateral o a un pie.

Materiales para el derribo, torcedores y trabones.
- Necesitamos un correaje especial de derribo, compuesto por cuatro collares colocados en el menudillo de las extremidades, llamados trabones. Éstos llevan una anilla por la que puede pasar una cuerda, mediante la cual, al tirar de ella, se juntan las extremidades y el animal pierde el equilibrio y cae.
- Trabón clásico (portalazos): se coloca más fácilmente, pero hay que quitarlo.
- Trabón inglés: más difícil de colocar, pero al dar un tirón a la cuerda cae solo.
- En caso de no tener trabones podemos arreglarnos con una cuerda y una argolla.
- Lo importante es que el trabón portalazos debe colocarse en una extremidad anterior, porque soportan más peso y son más difíciles de desplazar. Es por ello más fácil de mover las extremidades posteriores hacia la parte de delante (remeterlas), ya que soportan menor peso y se flexionan mejor por los corvejones. La extremidad anterior donde coloquemos el trabón será la contraria al lado que queremos que caiga el animal.

Para realizar un derribo hay que aplicar cuatro fuerzas:
- en la cabeza hacia el lado del derribo (evitando torcerla en caballos, aunque no en vacas);
- en la cola, tirando hacia el lado del derribo;
- en la cuerda que aproxima las extremidades, traccionando hacia el lado contrario del que queremos tirar al animal;
- mediante una cincha y una cuerda atada a la misma, a nivel del pecho, tirando hacia el lado del derribo. También pasando la lazada por la axila del lado contrario del derribo y luego por la espalda.

Los métodos de derribo se clasifican de dulces (usados en general en vacas) y violentos (para caballos), aunque algunos se usan indistintamente.

Dentro de los violentos nos encontramos con:

* Método alemán o berlinés: Consiste en colocar cuatro trabones con anillas, uno en cada extremidad a la altura de las cuartillas, con las hebillas hacia fuera y las anillas hacia dentro, situando en la extremidad anterior del lado contrario del que queremos derribar al animal, el trabón portalazos, ya que, a partir de él se pasará la cuerda a través de las otras tres anillas y luego por la primera anilla. Antes de poner los trabones hay que poner una correa que vaya desde la cruz (por debajo de la extremidad anterior contraria del lado del que se va a derribar) para facilitar la pérdida de equilibrio del animal al tirar de ella lateralmente, aproximando las extremidades con la misma. Un auxiliar sujeta la cabeza, otra la cola y dos o tres cogen el cabo libre de la cuerda de tiro, tras la extremidad delantera. Nada más haber inyectado la sustancia narcotizante se procede al derribo. Para la maniobra de puesta en pie del animal, se suelen abrir primero los trabones que se encuentran debajo del animal, y luego los restantes, teniendo precaución porque se levanta muy violentamente. Es el más usado, especialmente cuando queremos realizar castraciones en machos.

* También se puede hacer este método anterior, pero sin trabón portalazos, atando a la argolla o sin atar, pasando por todo y con un lazo corredizo, es decir, los cuatro trabones se juntan con una sola cuerda de tiro y la platalonga pasa por el centro del cuerpo; a esta modificación se le denomina sistema de Munich.

* Método de Stuttgart: Utilizado cuando se quiere explorar la zona abdominal. Se necesitan cuatro trabones, dos de ellos portalazos. Éstos se colocarán en las extremidades en la anterior derecha y en la posterior izquierda, (por diagonales), en caso de que queramos que el caballo caiga hacia el lado derecho, colocando los otros dos trabones en las extremidades que quedan. Además se requiere una cincha con anillas. Al igual que los dos métodos anteriores, una correa va desde la cruz y pasa por debajo de la extremidad anterior contraria del lado de la caída, ayudando al derribo del animal. Tras el derribo se mantienen unidas las extremidades anteriores y posteriores del mismo lado y aproximadas al tórax mediante las anillas de las cinchas, y las posteriores al vientre. Necesitamos que en cada uno de los extremos tiren oblicuamente dos personas, hacia delante y hacia atrás. Una vez terminado el derribo (tras la operación,…), se suelta primero la atadura del cincho y el animal procederá tumbándose sobre un costado.

* Método Danés: También requiere el uso de cuatro trabones, (dos de ellos portalazos), y una cincha con dos anillas a nivel dorsal y ventral. Si queremos derribar al animal hacia el lado izquierdo, se coloca la cincha con la hebilla hacia el lado derecho y las anillas en la disposición anterior, luego los trabones de forma que los portalazos se sitúen en la extremidad anterior derecha y otro en la posterior derecha; pasamos la cuerda por el portalazos anterior y las anillas del trabón de la extremidad anterior y posterior izquierda para pasarla por la argolla ventral de la cincha; la cuerda procedente del trabón portalazos de la extremidad posterior derecha se pasa por la argolla situada a nivel dorsal, tiramos de las cuerdas a la vez que un ayudante gira la cabeza del animal hacia la derecha, desplomándose el animal como consecuencia. Si queremos mantener estático al animal tras el derribo, fijamos tres extremidades a la anilla ventral (las anteriores y la posterior izquierda) y la restante se aproxima.

* Método de Madsen, usado tanto para ganado vacuno como equino. No “quema las cuartillas” y usa cuerdas. También hay una modificación del mismo añadida por el profesor D. Cristino García Alfonso. Lo detallo a la hora de hablar respecto a derribos dulces en vacas.

* Hay muchas más modificaciones a partir de los anteriores, como los de Gauer, de Cheichowsky o el procedimiento usado por los esquiladores.

Dentro de los derribos dulces:

* Método de Jong: Se utiliza cuando queremos derribar vacas sin cuernos. La cuerda se ata en forma de U alrededor del tórax y abdomen del animal, pasando los extremos de la cuerda por la U a la altura de la línea paravertebral, haciendo presión sobre la columna vertebral al tensar los extremos de la cuerda, derribando con ello al animal.

* Método Italiano: Si colocamos la cuerda por la parte media del animal, sobre la nuca de éste, pasándola por debajo de las extremidades anteriores, cruzándola sobre la espalda y entre las dos patas traseras, y tiramos de las cuerdas hacia atrás, lograremos que el animal caiga. También se le denomina método de Szabó.

* Método de Rueff: En vacas con cuernos, realizamos un nudo en los mismos y, desde ahí, hacemos tres vueltas de cuerda, una a la altura del cuello, otra en el pecho y otra en el vientre; (en caso de no tener cuernos, la primera vuelta se realiza alrededor del cuello). Se tira hacia atrás con dos hombres, uno tirando de cada cabo. También se conoce como método de Hertwing.

* Método de Madsen: Se atan las extremidades anteriores a la altura de las cuartillas, (en forma de ocho), y las posteriores se atan independientemente con dos cuerdas. Pasamos los extremos libres de las cuerdas por debajo de las ataduras y por el lado contrario del que se quiere tirar al animal. Tiramos hacia atrás de los extremos de las cuerdas a ala vez que un auxiliar gira la cabeza del animal y otro tira de la cola hacia el lado que queremos derribarlo.

¿Cómo llevamos a cabo la separación de una extremidad con respecto del tronco?

Es necesaria cuando queremos realizar operaciones en la misma o en la contraria, que se encuentra debajo, o en caso de querer hacer una castración (actuaciones a nivel del bajo vientre).
- Usamos una cuerda, la platalonga o un palo separador. En caso de querer separar una extremidad posterior, ponemos en ella un trabón principal a la altura del metatarso o atamos una cuerda con un nudo alrededor del mismo. Tiramos de la extremidad con la cuerda hacia delante hasta que el metatarso se encuentre “encima” del metacarpo. Podemos colocar entre los dos antebrazos una almohadilla.
- Si se quiere hacer una castración, se coloca una vuelta de cuerda encima de la articulación del calcáneo con el astrágalo de la extremidad cercana (la que se encuentra encima); el cabo libre se pasa entre las extremidades anteriores y por debajo de la cabeza y el cuello, por encima de la cruz y vuelve hasta el menudillo de la extremidad. Desde ahí se ata y se tira desde la espalda, quedando el casco a la altura del codo o de la articulación del encuentro. Tras terminar la intervención, se suelta la cuerda quedando sujeta sólo por el trabón.
- También podemos utilizar un palo separador (bastón), cuya longitud puede ser de unos 100 cm con otros 6 cm de diámetro. En cada extremo del mismo se ha sujetado un trabón. Si lo requerimos para separar extremidades anteriores, se pone primero el bastón en la extremidad posterior más cercana (la de encima), tirando de la anterior correspondiente hacia delante con una cuerda, y colocamos el segundo trabón en el antebrazo de la misma.

Potros de sujeción:

- Muy estresante para caballos. Útil para ganado vacuno, sobretodo en arreglos a nivel de las extremidades y casco.
- El potro ideal debe tener unas características específicas:
* sólo caber un animal;
* perfecto acceso del clínico al animal sin tener que entrar en la estructura;
* suelo no deslizante;
* que no pueda salir el animal, es decir, cerrado por delante y por detrás;
* método de sujeción de la cabeza, para evitar lesiones al moverse;
* debe poder abrirse por los cuatro lados;
* correas y tornos para sujetar al animal;
* sistemas para fijar las extremidades;
* puede tener ruedas para su mejor movilidad;
* contrariamente al anterior punto, también puede ser fijo;
* ej: jaula de tratamiento de bóvidos de Kastner.

Métodos de derribo y sujeción de Suidos:

- Método de Michalik (o lazo para el maxilar superior): se coloca una persona al lado del animal realiza un nudo con la cuerda alrededor de la boca, hasta quedar colocada tras los colmillos. Hace otra vuelta de cuerda por encima de la primera, cierra las mandíbulas y ata a los lados de la mandíbula.
- Si pasamos tras la actuación anterior el extremos libre de la cuerda por debajo de la extremidad posterior contraria del lado hacia el que queremos derribarlo, tirando de la cuerda de abajo hacia arriba, conseguiremos, a la vez que no abra las fauces, que caiga al suelo y luego la posterior inmovilización, mediante fijación de la cuerda con un nudo o dos en forma de ocho.
- Otro método es el de Haake, que consiste en cuatro lazos de cuerda con una argolla de hierro en cada una y el uso de una cuerda de unos cinco metros. Los lazos se colocan por encima de los dedos supletorios y, con la cuerda se juntan las patas del animal, tumbándolo sobre un costado.

Métodos de inmovilización de Cánidos:

- Atamos las mandíbulas del perro con una gasa (cinta no muy estrecha y resistente) de un metro de largo, de forma que el nudo quede debajo de la mandíbula inferior. Después, con los cabos libres, los pasamos por detrás de las orejas, donde volvemos a anudarla.
- En caso de ser intervenciones que requieran que esté de costado o tumbado el perro, cogemos al animal por encima de la espalda y sujetamos las articulaciones carpal y tarsal, y, con nuestros antebrazos presionamos sobre el costado del perro, mientras levantamos las extremidades, perdiendo el animal el equilibrio y colocado sobre el costado que queramos.
- Para sujetar las extremidades, se coloca en una posterior, con un lazo en el centro de ella. Luego se fija a la anterior que se encuentra debajo, después a la posterior de encima y luego a la otra anterior que está encima. Así quedarán superpuestos los carpos y los tarsos.

RETALES PARASITOLÓGICOS (II)

Trypanosoma spp.

PARÁSITOS HEMÁTICOS

Infectan la sangre de animales domésticos. Hay especies pertenecientes a cuatro géneros, que los podemos dividir en dos grupos:

· Flagelados ( Trypanosoma y Leishmania) à Ambos son kinetoplástidos (poseen un kinetoplasto, que es una mitocondria especial, que se hace evidente al teñir las muestras). Trypanosoma se transmite mediante la mosca “tsé-tsé” y Leishmania mediante la “mosca de la arena” ( o “beatilla”).
· Apicomplejos (Babesia y Theileria), cuyos vectores infectantes son garrapatas.

(a) Trypanosoma

Se encuentra en la sangre de Rumiantes, conejo,… y en los tejidos de los animales vertebrados en general. Su morfología es característica, ya que tiene un cuerpo celular alargado, con el núcleo a la mitad. El kinetoplasto se tiñe y se aprecia en al inmediaciones de la inserción del flagelo (postnuclear). El flagelo surge de la zona posterior y se dirige a la parte anterior, asociado a una membrana ondulante.

Se debe realizar la muestra con sangre sin anticoagulante, extendiendo perfectamente la misma entre dos portas. Se desliza rápidamente el porta formando un ángulo de 30-45º, para que la extensión sea lo más fina posible.

La tinción con Giemsa:
- fijar la extensión durante 3 minutos con alcohol metílico o etílico absolutos;
-teñir con solución de Giemsa;
- lavar con agua destilada y secar.

Son parásitos extracelulares, por ello hay que buscarlos entre las células de la sangre. Tienen un aspecto más o menos sinuoso. A 100 aumentos se ven perfectamente. A 400 aumentos se identifica si la prueba es positiva o no.

Se dividen por fisión longitudinal; a veces pueden formar ovillos, porque no les ha dado tiempo a dividirse del todo.

Uno especial es el Trypanosoma equiperdum, que ha perdido el factor biológico, se va a los Équidos y se transmite de manera venérea. Tiene un aspecto granular.

Diagnóstico
- Mediante la historia clínica, los signos clínicos y la observación de las lesiones.
- Inmunodiagnóstico.
- Mediante la tinción de extensiones de sangre, improntas de ganglios linfáticos y de líquido cerebro-espinal.

b) Leishmania

Son amastigotes (cuerpo oval sin flagelo libre) en órganos del sistema retículo-endotelial (ganglios linfáticos, bazo, hígado, etc).

Un diagnóstico presuntivo en el perro sería el observar en una preparación corpúsculos ovalados muy pequeños, cuyo núcleo se tiñe, tienen kinetoplasto, un pequeño flagelo,… Para confirmar el diagnóstico hay que recoger una muestra de los ganglios, una biopsia del hígado, etc.

En resumen:
* Muchos macrófagos (cél. grandes). Dentro las Leishmanias.
* Núcleo circular teñido.
* Membrana celular bastante fina. Macrófagos no infectados, de color azul.
* Infectados à corpúsculos muy teñidos dentro de los macrófagos à son las Leishmanias. Cuando está repleta la célula, estalla y se infecta la célula sana.
* También se aprecian grupos muy numerosos teñidos que tapan a la célula hospedadora. Hay corpúsculos sueltos, tras romperse, extracelulares.
* Se ve con el objetivo de 10 (poco). Con el de 40 confirmamos el diagnóstico.

Diagnóstico:
- Signos clínicos y lesiones.
- Inmunodiagnóstico.
- Tinción de improntas de los ganglios linfáticos y médula ósea.

(c) Babesia

La babesiosis es una enfermedad infecciosa causada por un Apicomplejo que se localiza intracelularmente, dentro de las células sanguíneas (intraeritrocítico), no dentro de las células de la serie blanca.

Los zoítos de Babesia son muy característicos, ya que se muestran con morfología “piriforme” dentro de los GR, siendo de tamaño variable (reducidos o grandes); a veces es habitual que, al multiplicarse intraeritrocíticamente, no se dividan del todo, permaneciendo unidos dos hasta incluso cuatro zoítos. También podemos encontrarnos con Babesias irregulares, con formas de anillo,… Estos fenómenos suelen ocurrir cuando la multiplicación es muy elevada.

Los agentes más importantes que suele presentar el perro son Babesia gibsoni y Babesia canis, éste último poco frecuentemente en el gato. Es considerada una zoonosis, aunque no hay una especie de babesia propia de los humanos, las infecciones suelen provenir de contactos con los animales domésticos y de roedores. La transmisión se da por la picadura de garrapatas, aunque existen otros vectores como la picadura de mosca y las secreciones de los animales.

La clínica varía desde cuadros de carácter agudo a leves, incluso subclínica, por lo que la enfermedad puede pasar desapercibida. Clínicamente se observa:

* Fiebre * Decaimiento * Anemia * Ictericia * Anorexia

* Hepatomegalia y esplenomegalia * Signos respiratorios (disnea), vómitos, diarrea, coagulopatía, CID, dolor lumbar y síntomas neurológicos (convulsiones y ataxia).

El diagnóstico se lleva a cabo mediante el análisis del historial clínico y lesional, un análisis de sangre que permite identificar los parásitos dentro de los GR:
- Frotis sanguíneo (sangre de Car, Ov, Bo, Cap, Eq,…) y tinción con Giemsa.
- Estudios serológicos e inmunodiagnóstico.

(d) Theileria

Son también parásitos intracelulares. En este caso, cuando las garrapatas introducen los zoítos, entran en las células de la serie blanca, multiplicándose por esquizogonia o merogonia. De hecho, son esquizontes en linfocitos y merozoítos dentro de los eritrocitos.

Su ciclo posee tres fases:
· Fase linfoproliferativa: los esporozoítos inoculados por la garrapata van por vía linfática a parasitar linfocitos, que dan lugar a células hijas también infectadas Los linfocitos parasitados pueden ir vía linfática hasta situarse en otros órganos linfoides, diseminando la infección, pudiéndose detectar al final de esta fase en múltiples nódulos linfáticos, en las placas de Peyer, y en el tejido intersticial en pulmón.
· Fase de desorganización y depleción, donde se observa atrofia y necrosis linfoide. Hay destrucción y desorganización del tejido linfoide, originando una inmunosupresión.
· Fase hemoproliferativa y hemolítica: en ella, algunos esquizontes evolucionan hacia merozoítos, parasitando entonces a los eritrocitos. Como consecuencia habrá anemia e ictericia.
En caso de superar estas tres fases, el animal quedará portador del parásito, alcanzado un equilibrio entre su sistema inmune y el parásito que se podrá interrumpir volviendo al cuadro clínico inicial.

Clínica:
- Forma aguda y subaguda: transtornos sanguíneos,fiebre, anorexia, falta de apetito, debilidad, sialorrea, transtornos cardiacos y respiratorios, linfadenomegalia, agalaxia, muerte, etc. También transtornos a nivel renal.
- Forma hiperaguda: linfadenomegalia, fiebre alta, anorexia, agalaxia, transtornos respiratorios y cardiacos, convulsiones, debilidad extrema,… Suele causar la muerte en poco tiempo.

Diagnóstico:
- Mediante el análisis del historial clínico, signos y lesiones.
- Inmunodiagnóstico.
- Detectar macroesquizontes y microesquizontes en improntas provenientes de órganos linfáticos (como los ganglios o el bazo).

EL GLAUCOMA EN ANIMALES (I)

Visión general de la anatomía ocular.

SIGNOS Y SÍNTOMAS CLÍNICOS

El glaucoma es uno de los trastornos más frecuentes a nivel del segmento anterior del ojo. Los signos clínicos que evidencia dependen tanto del tipo de glaucoma como de la fase en que se encuentre dicho trastorno, variando a su vez en las distintas especies animales (Équidos, Cánidos, Félidos).

Por todo ello, se van a tratar los signos característicos que se manifiestan en cada una de las situaciones para realizar al final un cuadro sinóptico con los que comparten todos ellos.

(a) Según el modo de presentación:

a.1.- Glaucoma agudo (primario)

Hay un aumento en la Presión Intraocular (PIO), que produce signos evidentes en el perro y en el caballo, no así en el gato.

Por norma general, este trastorno origina una alteración en la transparencia de la córnea, dando lugar un Edema Corneal. Si este síntoma no se soluciona, debido a que no desciende la PIO, aparece otro problema añadido, Dolor Intenso. El ojo está aumentado de tamaño, buftálmico (especialmente en los Équidos). También hay otros signos evidentes, como el excesivo lagrimeo blefarospasmo, fotofobia, intensa hiperemia en vasos episclerales (ojo rojo) y pupila dilatada (midriática).

Esto siempre ocurre en el caso de perros y caballos, aunque en éstos es característica la aparición de franjas opacas corneales profundas, donde el espesor de la membrana de Descemet está disminuido, y, en general, el dolor es menor, con una ligera Iridociclitis.

El comienzo de los signos en gatos es insidioso, ya que no se aprecian con facilidad el edema y la congestión episcleral. Los gatos suelen presentar glaucomas secundarios a una uveítis, neoplasias intraoculares,… que producen la formación de protuberancias. De producirse primario, suelen ser de ángulo abierto. También se presenta en ellos buftalmía, especialmente por luxación del cristalino. De todos modos, la buftalmía puede no evidenciarse debido a que los párpados pueden ocultar el aumento del tamaño del ojo.

En vacuno se asocian a anomalías iridocorneales y a uveítis anterior.

a.2.- Glaucoma crónico (primario)

Se debe al desarrollo del glaucoma desde su fase aguda, y conlleva lesiones irreversibles en el nervio óptico. La primera diferencia con el agudo es que no se aprecia tanto dolor. En general, los signos clínicos son menos visibles en perros y gatos.

- En perros son secundarios a luxaciones del cristalino, así como a la propia buftalmía. Se pueden llegar a formar membranas fibropupilares preiridales y sinequias (ya que se obstruye el ángulo de filtración con células inflamatorias, fibrina y restos celulares), empeorando más aún el drenaje del humor acuoso, aumentando con ello la PIO. Además, también pueden ser secundarios a uveítis, neoplasias,…

- En gatos, al igual que el glaucoma agudo, puede formarse glaucoma crónico por cronicidad de una uveítis anterior. También por obstrucción de la filtración del humor con células inflamatorias,… Se aprecia buftalmía, queratitis y luxación del cristalino. También lagoftalmos,…

- En Équidos no se suele presentar, aunque, en caso positivo, se apreciaría buftalmía, dolor crónico y evolución a la ceguera.

a.3.- Congénito

Se podría hacer otro apartado con los glaucomas congénitos. En general se apreciaría buftalmía muy manifiesta, edema corneal, blefarospasmo, afectación de la membrana de Descemet,… y alteraciones en al trama trabecular, el limbo esclerocorneal,… Afectan a animales jóvenes, por mal desarrollo de las vías del humor acuoso.

a.4.- Secundario

Suelen derivarse de una causa genética, tras afectación del cristalino en unas cataratas o por luxación o subluxación del mismo. Hay obstrucción de la salida de humor acuoso. Son uni y bilaterales.

(b) Según la evolución del glaucoma:

b.1.- Inicial/Temprana

Aunque puede no presentar síntomas, pueden aparecer periodos transitorios de midriasis y edema corneal. También se observa hiperemia en los vasos episclerales. La PIO está entre 20 y 30 mmHg.

b.2.- Ligera/Moderada (Intermedia)

Se caracteriza por presentar midriasis, congestión de los vasos episclerales y edema corneal, pero se empieza a apreciar buftalmía y luxación de cristalino en fase inicial. La PIO es de 30-40 mmHg. La visión es algo menor.

b.3.- Avanzada

Importante midriasis, edema corneal, buftalmía, sinequias y adherencias en la córnea. Hay degeneración de la retina y del disco óptico, y más alteraciones de carácter grave. La PIO está entre 40-50 mmHg. La visión está muy disminuida llegando incluso hasta la ceguera.

* También podemos analizar los síntomas según las razas de perros, gatos o caballos, pero no diferirían en lo más característico. Desde un punto de vista clínico, se puede hacer una sinopsis con los signos más visibles, sin atender al tipo de animal, evolución o presentación. Son:

• Elevación por encima de 25-30 mmHg de la PIO.
• Dolor y aumento de coloración rojiza del globo ocular (congestión de los vasos episclerales).
• Edema corneal.
• Pupilas dilatadas (midriáticas).
• Buftalmía.
• Lagoftalmos.
• Queratitis.
• Luxación del cristalino.
• Atrofia del disco óptico y retina.
• Formación de sinequias.
• Almacenamiento de células inflamatorias y fibrina en el ángulo de filtración.
• Blefarospasmo.
• Fotofobia.
• Lagrimeo intenso.
• Alteración a nivel de la membrana de Descemet.
• Ceguera
• Apatía, decaimiento, depresión,…

Concretando, y de un modo resumido según el tipo de glaucoma:

A) Glaucoma primario (crónico) [Ángulo abierto]:

• Frecuente en perro, raro en gatos.
• Anisocoria.
• Edema corneal difuso.
• Leve inyección episcleral.
• Aumento de tamaño del globo ocular.
• PIO 30-40 mmHg.
• Luxación cristaliniana.
• Pérdida irreversible visión.
• ¿Y el nervio óptico, cómo está?

B) Glaucoma primario (agudo):

• Dolor.
• Color azul corneal (hay edema).
• Midriasis.
• Inyección ciliar.
• Pérdida de visión.
• Buftalmos (en caso de que persista).

C) Glaucoma secundario:

• Anomalías del cristalino.
• Tras cirugía de catarata.
• Anomalías en la úvea.
• Medicaciones.
• Goniodisgenesias.

DIAGNÓSTICO

El glaucoma es fácilmente diagnosticable, ya que sus signos clínicos son bastante evidentes. Lo difícil es averiguar la causa originadora del problema.Se suele centrar en la percepción del aumento en la PIO, así tenemos un método diagnóstico como la Tonometría. También nos podemos basar en el ángulo iridocorneal, fundamento de la Gonioscopia. Aunque sean los dos procedimientos más fiables, también podemos usar otros complementarios, que nos ayudarán en otros aspectos relacionados, como:

- Oftalmoscopia (directa/indirecta).

- Retinoscopia.

- Tonografía.

- Ecografía ocular.

- Electrorretinografía.

- Angiografía fluoresceínica.

- Campimetría.

- Citología conjuntival.

- Biomicroscopía con lámpara de hendidura.

- Radiología.

- Queratoscopía.

A) Tonometría

Permite valorar la PIO. Existen varios tipos de Tonometría:

A.1.- Tonometría digital:

Se basa en la aplicación de presión en los ojos mediante los dedos de la mano. Se evalúa mediante un masaje en los párpados superiores, y en los dos ojos a la vez, para compararlos. No es un sistema muy perfecto, ya que no es objetivo y requiere mucha experiencia, así como la comparación con un globo ocular normal (sano).

A.2.- Tonometría por indentación (Schiotz):

Mide la indentación de la córnea producida por un Tonómetro de Schiotz. Éste está constituido por un émbolo que se desplaza por un cilindro hueco centrado en un vástago y tiene también una plataforma adaptable que se coloca sobre la superficie corneal, previamente anestesiada (localmente con proximetacaína). No debe tocar los párpados en su descenso ni el tercer párpado. Se hacen tres lecturas siempre, que difieran menos de 1-2 unidades entre sí.

Este sistema sugiere distintos problemas, como que el tamaño del globo ocular, la variación de la rigidez escleral respecto de la edad o las lesiones a nivel corneal afectan a los datos obtenidos.

Deben tenerse en cuenta unas consideraciones para su uso óptimo:

• Hay que calibrarlo siempre al principio (“puesta a punto”).
• Debe estar completamente limpio, ya que, en caso contrario, daría lecturas no fiables.
• La anestesia local de la córnea debe realizarse con cuidado, evitando incrementar o reducir la PIO como consecuencia. Asimismo, cuidado al realizar la prueba, intentando no tocar el tercer párpado, el limbo o los párpados, en general.
• No realizar este procedimiento en caso de una intervención ocular muy reciente o de edema corneal que lo obstaculice.
• Realizar varias mediciones y siempre en los dos ojos.

A.3.- Tonometría por aplanamiento:

Mide la fuerza necesaria para aplanar una pequeña superficie de la córnea.

Se usa un Tonómetro (Tono-Pen), compuesto por una sonda de acero que posee dentro un calibrador electrónico. Al contactar éste con la córnea (mediante una membrana esterilizada) se produce una onda que indica la PIO que se quiere saber. Hay que realizar cuatro mediciones (a diferencia de las tres del Tonómetro de Schiotz). Requiere anestesia tópica también.

Las ventajas respecto a la anterior son:

• Mayor precisión.
• No hace falta inmovilizar tanto al animal.
• Mayor comodidad.

El mayor inconveniente es el elevado coste que tiene.

En ganado vacuno y en el caballo sólo se pueden usar este tipo de tonómetros.

B.- Gonioscopia:

Mide la alteración del índice de refracción corneal a medida que evoluciona el glaucoma. El ángulo iridocorneal, así como las vías de drenaje se observan mediante una lente refractiva que se coloca en la superficie de la córnea, permitiendo así que la luz reflejada pase desde la región del ligamento pectinado hasta el ojo del explorador veterinario. Requiere anestesia tópica. Las lentes más usadas son las de Barkan, Franklin Goldman o Koeppe. El mecanismo, aunque parezca complicado, es bastante sencillo.

A la interfase entre la lente gonioscópica y la córnea, aparte de haberle aplicado anestesia, también debe tener suero salino (o solución de metilcelulosa al 1% en otros casos). De este modo se forma una película con presión negativa, que ayuda a que la lente permanezca unida a la córnea.

Aparte de la lente y demás líquidos, también requiere el uso de lupa (aunque lo mejor es el biomicroscopio) y una fuente de luz (procedente del propio oftalmoscopio). Tenemos que observar antes de llevar este procedimiento a cabo si hay depósitos de fibrina, células inflamatorias,… y proceder a su limpieza para no interferir en la medida. También evaluar si hay alteraciones en el ligamento pectinado (o pectíneo) o infiltrados neoplásicos.

Mencionar también que el sistema de las lentes Goldman y Barkan, (las más usadas) es algo distinto, ya que, mientras en las primeras el ángulo iridocorneal se observa indirectamente a través de un espejo que lleva la lente, en los segundos se ve el ángulo directamente. El resultado más frecuente en perros es observar el ángulo de filtración estrecho o cerrado, así como displasia en el ligamento pectíneo.

- Otro método “casero” en el supuesto de que no tengamos posibilidad de adquirir este tipo de lentes se basa en el uso de lentes de condensación de 20-30 dp, que se colocan encima de la córnea y se presionan (con el ojo previamente anestesiado y tras lubricarlo). De este modo veremos cómo está el ángulo de drenaje.

C.- Técnicas Complementarias:

Aunque para el diagnóstico del glaucoma se recurre a los dos procedimientos antes tratados, también se pueden realizar otras pruebas que ayudan a su detección y confirman el diagnóstico, pero no están sistematizadas desde el punto de vista de la Oftalmología Veterinaria. Vamos a citar brevemente cuáles son las más utilizadas y su mecanismo básico.

C.1.- Oftalmoscopía:

Se emplea para explorar el fondo del ojo. El instrumento usado es el oftalmoscopio, habiendo suministrado midriáticos al animal y llevando a cabo la operación en oscuridad.

Mediante la oftalmoscopía directa se incide la luz a través de la pupila, que refleja y vuelve al ojo del explorador veterinario. De este modo, si la imagen no es nítida, se puede sospechar de alguna anomalía. Con ella se explora especialmente el segmento anterior del ojo.

Las diferencias con la indirecta es que, aparte de que la imagen que se ve es invertida (y con menos aumentos que la directa), es más compleja de realizar, con ésta se examina especialmente la cámara y el segmento posterior del ojo.

C.2.- Ecografía oftálmica:

Emite ondas de sonido de elevada frecuencia, que van desde la córnea hacia el fondo del ojo, y los ecos producidos se reciben y originan una imagen. Aparte de examinar el globo ocular, también se evalúan los tejidos blandos y óseos de la órbita. Puede detectar opacidades, desprendimientos de retina, tumores,…

Hay dos tipos de ecografía, la ecografía unidimensional en modo A (que mide parámetros biométricos, como el espesor corneal o el grosor del cristalino) y en modo B (que examina la existencia de lesiones en estructuras internas).

C.3.- Radiología:

No se usa mucho, aunque sí como antesala de una posterior RM, TAC o Ecografía. También se puede hacer junto con el uso de colorantes de contraste, para evaluar otras lesiones.

C.4.- Retinoscopía:

Evalúa el estado refractivo del ojo. Se basa en la iluminación de la retina emitida por un retinoscopio. De este modo se consigue ver la potencia refractiva del ojo. Mediante esta técnica de refracción se diferencian los problemas tan típicos como la miopía, la hipermetropía o el astigmatismo.

C.5.- T.C. de la córnea (Queratoscopia):

Explora la curvatura de la superficie corneal, proyectando sobre ella anillos concéntricos de luz (disco de Placido). Luego se mide la distancia entre los mismos y se ven las alteraciones. Antes de llevar a cabo la técnica de refracción (retinoscopia) se debe tener en cuenta la realización de esta prueba.

C.6.- Biomicroscopía de lámpara de hendidura:

Examina los distintos elementos del globo ocular, observando las lesiones que pudiera haber en los anejos, córnea, cámara anterior, etc.

Se compone de un diafragma con una hendidura que, de una imagen tridimensional, proyecta un chorro de luz sobre las estructuras. Dependiendo de si queremos observar el segmento anterior o posterior, las lentes son diferentes.

C.7.- Electrofisiología ocular:

Estudia los potenciales eléctricos debidos a la actividad de las células visuales, vías ópticas y córtex visual. Dentro de este apartado está el ERG (Electrorretinografía) y el PEV (Potenciales Evocados Visuales).

El primero registra la respuesta a un estímulo luminoso según la diferencia de potencial entre la retina y la córnea, cuando la retina es fotoestimulada.

El segundo registra potenciales eléctricos de la corteza visual tras ser estimulada también la retina. Mediante esta técnica se valoran los componentes de la retina y las vías visuales, diferenciando si el problema es a nivel periférico o central.

C.8.- Angiografía fluoresceínica:

Evalúa la existencia de problemas funcionales en la vascularización del ojo tras el paso de un colorante acuoso (fluoresceína) por los vasos corioides y retinianos. Resulta muy eficaz para detectar inflamaciones y el edema corneal.

Si la fluoresceína se observa de color verde tras su aplicación indica lesiones corneales y alteración de la permeabilidad de las vías lacrimales.

C9.- Citología conjuntival:

Mediante esta prueba se identifican células inflamatorias, epiteliales, fibrina y otros elementos (bacterias, inclusiones,…), básicas para esclarecer procesos inflamatorios o neoplásicos en el globo ocular, que agravan el proceso del glaucoma. Se realiza un raspado suave de la superficie (con más o menos profundidad) y se tiñe y fija con metanol.Suele ser recomendable anestesiar, pero nunca localmente, ya que puede afectar la anestesia a alguno de los elementos antes citados.