El Clembuterol es un fármaco empleado en enfermedades respiratorias como broncodilatador. Desde hace treinta años se tiene constancia de que los animales alimentados con clembuterol aumentaban su masa muscular en detrimento de sus grasas. Estos efectos son similares a los producidos por otros beta-agonistas, en concreto su acción es principalmente B1, aunque también B2 y alfa.
El clembuterol es legal como medicamento por su efecto relajante de la musculatura lisa, por ser útil como broncodilatador (en la EPOC equina) o por actuar como tocolítico para partos complicados. Asimismo estimula el depósito de proteínas y contribuye a la reducción del depósito de grasas (por ello se empezó a usar como hormona esteroidea; su problema es que permanece en la carne). El nombre comercial es Ventipulmin.
Los residuos de Clembuterol pueden afectar las funciones de pulmones y corazón en seres humanos, que ingieren carne o hígado de animales a los que les ha sido administrado clembuterol. En 1990 se produjo una muerte humana en Asturias; sus síntomas fueron inespecíficos (fallo respiratorio, no termorregulación, palpitaciones, náuseas, boca seca,…). Era un cuadro parecido a la intoxicación por un beta-agonista. Parece ser que se trataba de un hombre que había estado comiendo durante mucho tiempo carne de vacas a las que se le había administrado gran cantidad de clembuterol de manera constante. Actualmente se sabe que demasiado clembuterol en la carne no actúa como un promotor, sino como un estimulante del crecimiento.
Farmacocinética
Es un fenilaminoetanol con propiedades adrenérgicas que puede ser administrado por vía oral o intravenosa en los animales, almacenándose en el hígado (donde se produce su metabolización). Su excreción principal es por la orina (50-85%), por las heces (10%) y, en menor grado por la leche (1-5%).
En el caso de humanos, su absorción por vía oral es rápida y casi completa a los 45 minutos alcanzando unos niveles máximos en plasma a las 2 horas. Su eliminación es principalmente por orina (hasta el 90%).
Muestras a tomar:
- Orina.
- Hígado (si nos encontramos en un matadero).
- Acúmulo de humor vítreo (es menos seguro).
Determinación:
- Hígado (si nos encontramos en un matadero).
- Acúmulo de humor vítreo (es menos seguro).
Determinación:
+ ELISA: es útil, barato y nos permite analizar 96 muestras a la vez. Si se genera una reacción Ag/Ac, cambia el color. Su principal inconveniente es que pueden existir falsos positivos. De todos modos nos sirve como “screening” previo; lo que sí sabemos es cuándo es negativo y cuándo positivo, acotando mucho. En el caso de muestras dudosas pasamos a los siguientes métodos.
+ Cromatografía de masas/gases: es un método físico de separación donde los componentes a separar se distribuyen en dos fases, una es la fase estacionaria y la otra es un fluido (fase móvil), que pasa a través de una superficie (la anterior fase estacionaria). Es más exacta, obteniéndose valores en ppm o %. En el supuesto de tratarse de un informe pericial los resultados se deberían obtener mediante este método.
+ Cromatografía en capa fina: es rápida y barata. Su procedimiento lo analizo a continuación.
+ Cromatografía de masas/gases: es un método físico de separación donde los componentes a separar se distribuyen en dos fases, una es la fase estacionaria y la otra es un fluido (fase móvil), que pasa a través de una superficie (la anterior fase estacionaria). Es más exacta, obteniéndose valores en ppm o %. En el supuesto de tratarse de un informe pericial los resultados se deberían obtener mediante este método.
+ Cromatografía en capa fina: es rápida y barata. Su procedimiento lo analizo a continuación.
1.- Fundamento:
La muestra que podemos tomar puede ser de hígado o de orina, principalmente.
Si es hígado, éste se tritura, se digiere en ácido y se centrifuga. Se cogen 10 ml de sobrenadante y, con ayuda de la adición de gotas o pastillas de NaOH lo llevamos a pH 10-11, purificándolo y evaporando el metanol echado con el kit de purificación. Tras su evaporación resuspendo en acetato de etilo y lo aplico a la placa de sílice. El clembuterol lo podremos observar tras formar un azo-derivado con nitrito sódico y naftilen-diamina.
Como no vamos a trabajar con muestras de hígado sino con orina, el protocolo es más sencillo (ver 4.-Determinación).
La muestra que podemos tomar puede ser de hígado o de orina, principalmente.
Si es hígado, éste se tritura, se digiere en ácido y se centrifuga. Se cogen 10 ml de sobrenadante y, con ayuda de la adición de gotas o pastillas de NaOH lo llevamos a pH 10-11, purificándolo y evaporando el metanol echado con el kit de purificación. Tras su evaporación resuspendo en acetato de etilo y lo aplico a la placa de sílice. El clembuterol lo podremos observar tras formar un azo-derivado con nitrito sódico y naftilen-diamina.
Como no vamos a trabajar con muestras de hígado sino con orina, el protocolo es más sencillo (ver 4.-Determinación).
2.- Material:
- Cubeta cromatográfica.
- Placas de HPTLC de silicagel 60, 5 x 5 cm.
- Matraces.
- Micropitetas y pipetas graduadas.
- Pipetas Pasteur.
- Cubeta cromatográfica.
- Placas de HPTLC de silicagel 60, 5 x 5 cm.
- Matraces.
- Micropitetas y pipetas graduadas.
- Pipetas Pasteur.
3.- Reactivos:
- Clembuterol.
- Agua milli-Q o milli-Ro.
- NaOH.
- Cartuchos de C18 de 300 mg.
- Ter-butilmetil éter.
- Ácido acético.
- Ácido clorhídrico (1 N y 0.01 N).
- Acetato de etilo.
- Metanol HPTLC.
- Nitrito sódico.
- Gas nitrógeno.
- Naftiletilendiamina dihidroclorada (y al 0.4% en metanol).
- NaOH (2 N y 0.1 N).
- Nitrito sódico (al 1% en HCl 1 N).
- Eluyente de la capa fina (acetato de etilo: metanol: ácido acético --8:1:1).
4.- Determinación:
En la gradilla tenemos cuatro tubos: dos muestras, un blanco y un patrón (éste se hace a partir de otro patrón más concentrado con HCl). La extracción ya está realizada por lo que pasamos directamente a la purificación.
* Purificación:
- Preparamos los cartuchos de C18 pasando primero 5 ml de metanol y luego 5 ml de agua milli-Q.
- Pasamos por uno de los cartuchos de C18 la muestra (M4) y por el otro cartucho el blanco o patrón (en nuestro caso, patrón P2).
- Lavamos los cartuchos con 5 ml de agua milli-Q y, después, con 5 ml de una mezcla que hemos preparado de metano/agua (50-50) durante 2-3 ocasiones.
- Eluimos el supuesto clembuterol presente en los cartuchos con 3 ml de metanol y lo recogemos en un tubo de cristal para su evaporación.
- Evaporamos el metanol con la ayuda de nitrógeno (a 55º C o en un baño a 90ª C).
- Disolvemos la materia seca en 50 µL de acetato de etilo.
* Detección :
- Aplicamos la mitad de la disolución en una placa cromatográfica.
- Colocamos la placa en una cubeta hasta que el eluyente alcance el 60% de la misma aproximadamente.
- Dejamos secar la placa al aire.
- Se sumerge brevemente la placa en una solución de nitrito sódico 1% en HCl 1 N.
- Volvemos a secar la placa al aire.
- Sumergimos nuevamente la placa, pero en una solución de naftiletilendiamina 0.4%.
- Dejamos secar.
- El clembuterol presentará una mancha rosada (cualitativa) con una Rf de 0.4 aprox.
Fr = R / r -- Rf = r / R = d / D
El Rf del patrón (con clembuterol) es d / D <>
5.- Resultados:
+ Datos:
N = M x Valencia (la del HCl es 1).
M = moles/litro
Pm= 36.5
1litro= 1.19 kg.
37% (M/M – gr/gr).
Disolución 1 N HCl (100 ml).
¿M?
+ Cálculos:
37 gr x 1 mol x 1190 gr = 12.06 M
100gr x 36.5gr x 1 L
12.06 M x V1 = 1 M x 100 ml
V1 = 8.3 ml
37 gr x 1 mol x 1190 gr = 12.06 M
100gr x 36.5gr x 1 L
12.06 M x V1 = 1 M x 100 ml
V1 = 8.3 ml
+ Resultados:
La distancia en la placa cromatográfica desde la marca rosa de la muestra M4 hasta el lugar de aplicación de la misma fue de 2 cm, exactamente igual que la de la muestra patrón P2. El grupo vecino no obtuvo resultado positivo (tenían el blanco B2 y la muestra M3).
La distancia en la placa cromatográfica desde la marca rosa de la muestra M4 hasta el lugar de aplicación de la misma fue de 2 cm, exactamente igual que la de la muestra patrón P2. El grupo vecino no obtuvo resultado positivo (tenían el blanco B2 y la muestra M3).
Rf = 2 / 4.5 = 0.44 -- el Rf del clembuterol es 0.4, con una desviación de (+/-) 0.05.
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